Максим Франк-Каменецкий «Самая главная молекула»

Укорот в изложении Евгении Воробьевой

Максим Франк-Каменецкий «Самая главная молекула»

Самая главная книга

Максим Франк-Каменецкий — биофизик, профессор Бостонского университета. В 1983 году он был профессором Физтеха. Тогда он написал книгу «Самая главная молекула». Чтобы не было никаких сомнений, мы эту молекулу назовем. Это — ДНК, дезоксирибонуклеиновая кислота. Некоторые называют ее «двойная спираль», но Франк-Каменецкий предпочитает другое образное название — «штопор». Конечно, он прав, потому что никакой спирали ДНК не образует.

Мы поговорим о книге, которая вышла в 2017 году. У нее и автор тот же, что у книги 1983 года, и название совпадает. 

Многие ученые успевают за тридцать лет работы написать десяток-другой популярных книг. Франк-Каменецкий пишет одну. Но она меняется. Можно сказать, мутирует.

Второе, переработанное издание вышло в 1988 году. Первое англоязычное издание, для которого книга вновь была переработана, вышло в 1993 году, а второе английское издание — в 1997-м. Затем последовали русские издания — 2004 и 2010 года. Появляясь на разных языках, книга иногда меняла название, но всегда сохраняла главную тему — ДНК. Автор безжалостно вычеркивал все, что казалось устаревшим, и включал новые и новейшие исследования. 

Мутации этой книги, как любого живого организма, зависят от окружающей среды. В данном случае среда — это развитие молекулярной биологии. В этой науке за 40 лет произошло многое, и Франк-Каменецкий принимал и принимает самое активное участие в научной работе. Но его книга не разбухла от дополнений, она и сейчас небольшая. Она росла не «вширь», а вперед — в будущее.

Вот и последнее издание включает самые новые исследования и самые свежие идеи. Франк-Каменецкий касается многих научных теорий и экспериментов. Он рассказывает историю открытия структуры ДНК и генетического кода, описывает механизмы работы ДНК и порядок упаковки ДНК в ядре клетки. Но самая главная тема книги: как человек научился сначала читать ДНК, а потом и писать на ее языке. 

Алфавит

ДНК представляет собой последовательность нуклеотидов или букв. Алфавит состоит из 4 букв: А — аденин, Т — тимин, Ц — цитозин, Г — гуанин. 

ДНК состоит из двух комплементарно склеенных последовательностей, причем аденин в одной цепочке всегда соединяется с тимином другой, а цитозин — с гуанином.

ДНК определенным образом скручивается и укладывается в хромосомы. Это очень сложный процесс, за который отвечают специальные белки — гистоны. Длина ДНК человека — около двух метров, а размер клетки — это нанометры, то есть в миллиард раз меньше. Причем нельзя уложить ДНК кое-как. Она должна быть и компактна и доступна, чтобы в любой момент белки могли получить доступ к любому нуклеотиду. А этих нуклеотидов — миллиарды.

Некоторые фрагменты ДНК отвечают за кодирование белков и РНК. Такие фрагменты называются — гены.

Сегодня — это ликбез. А ведь всего 40-50 лет назад вот за эти самые знания, конечно, подкрепленные экспериментом, дали целую пачку Нобелевских премий.

Электрофорез

Чтобы работать с ДНК, нужно ее читать, то есть узнавать последовательность нуклеотидов. Ученые начали с того, что научились сортировать отрезки ДНК по длине. Если мы знаем длину ДНК, то знаем сколько в ней нуклеотидов. Это уже кое-что.

Обычно молекулы электрически нейтральны. А вот ДНК отрицательно заряжена. Это очень упрощает работу. Вряд ли природа заботилась об удобстве ученых. Если бы ДНК была нейтральна, очень осложнилась бы работа гистонов при ее упаковке. Можно считать, что ДНК снабжена «ручками» по числу нуклеотидов, чтобы гистонам было удобно ее «носить».  

Отрицательный заряд несут фосфодиэфирные связи, которые соединяют нуклеотиды в цепочку. Таких связей столько же, сколько и нуклеотидов. Если фрагменты ДНК поместить в постоянное электрическое поле, они будут притягиваться к положительному заряду. Если фрагменты плывут в вязком геле, он будет их тормозить. Короткие будут тормозиться слабее, а длинные — сильнее. В результате за единицу времени короткие продвинутся ближе к аноду, а длинные застрянут дальше. Если вдоль пути от катода к анода сделать лунки, то в каждой из них будут накапливаться фрагменты ДНК, имеющие одинаковую длину. Этот метод называется гель-электрофорез. Теперь мы умеем сортировать фрагменты ДНК по длине.

Само явление электрофореза был открыто еще в XIX веке, а сортировку фрагментов ДНК в геле начали применять в 1960-е. 

Читаем по слогам

Читать короткие отрезки ДНК научился Фредерик Сенгер. Франк-Каменецкий называет метод Сенгера «секвенирование с помощью синтеза». Сенгер приготовил молекулярный суп. Давайте последуем его рецепту.

Во-первых, приготовим однонитевые ДНК. Фосфодиэфирные связи, соединяющие нуклеотиды в цепочку, достаточно сильные, а водородные связи между двумя цепочками слабые. Если ДНК аккуратно нагреть, то водородные связи распадутся, а цепочки останутся целыми. Копий ДНК понадобится очень много. Для Сенгера это была серьезная проблема, но в 1980-е годы она была решена Кэри Муллисом. Он придумал полимеразную цепную реакцию, которая наращивает количество копий ДНК со скоростью геометрический прогрессии.    

Во-вторых, нам нужны нуклеотиды — очень много.

Во-третьих, нам нужен фермент ДНК-полимераза. Она прикрепляется к цепочке-образцу и начинает по ней собирать комплементарную цепочку. Если ДНК-полимераза «видит» в цепочке-образце аденин, она крепкой фосфодиэфирной связью присоединяет к своей цепочке тимин. И этот тимин приклеивает слабой связью к аденину в цепочке-образце. И так шаг за шагом. Подсмотрели в цепочке-образце, какой надо брать нуклеотид, выловили его из раствора, прикрепили сначала к своей цепочке, а потом к цепочке-образцу. 

Примерно таким образом ДНК-полимераза работает в живой клетке. 

Это немного напоминает застежку-молнию. ДНК-полимераза — это замок. Он сдвигается по одной стороне молнии, а вторую в это время синтезирует. Когда молния застегнется, вторая цепочка будет готова.

В-четвертых, нам нужен так называемый «почти-нуклеотид». За изобретение этого почти-нуклеотида Сенгер и получил Нобелевскую премию. ДНК-полимераза не отличает, что она выловила: нормальный тимин или «почти-тимин». Она присоединяет его к своей цепочке, приклеивает к аденину в цепочке-образце. И все вроде бы нормально. Вот только следующий нуклеотид к этому почти-тимину прикрепить нельзя. Синтез цепочки обрывается. 

Если у нас в растворе есть почти-тимин и никаких других почти-нуклеотидов нет, то мы точно знаем: все оборвавшиеся цепочки оборвались на том месте, где в цепочке-образце стоит аденин. Мы можем расплавить недостроенные ДНК, растянуть фрагменты электрофорезом и по длине этих фрагментов увидеть, где в образце стоит аденин. То же самое мы можем проделать и с тремя другими нуклеотидами.

На самом деле это была огромная победа. И сегодня метод Сенгера продолжает работать. Этот принцип реализован, например, в секвенаторе компании «Иллюмина». Правда, Франк-Каменецкий пишет, что устройство, которым пользовался Сенгер, похоже на современный секвенатор, как тачка на электромобиль. В «Иллюмине» все автоматизировано и ускорено. Но и у нее есть ограничение: она не умеет секвенировать длинные фрагменты ДНК и работает довольно медленно. 

Читаем бегло

Франк-Каменецкий рассказывает и о другом методе, который получил название «нанопоровое секвенирование». Эту идею с 1990-х годов разрабатывает оксфордский профессор Хаган Бейли. Он отказался варить молекулярный суп по рецепту Сенгера, а занялся шитьем. Даже не шитьем, а протягиванием нитки в игольное ушко.

Метод работает так. ДНК расплетают в растворе и протягивают через наноразмерное отверстие в мембране. В качестве такого отверстия, или нанопоры, часто используется белок альфа-гемолизин: он как раз образует цилиндр нужного размера. Когда ДНК тянут через нанопору, электрическое напряжение на мембране меняется. Причем оно зависит от того, какой нуклеотид в данный момент «затыкает» пору. Мы регистрируем напряжение на мембране и определяем последовательность нуклеотидов.

Протягивает ДНК через нанопоры все та же ДНК-полимераза. Без нее не обошлось. Двадцать лет усилий даром не прошли — идею нанопорового секвенирования удалось довести до товарного вида. Основанная Хаганом Бейли компания Oxford Nanopore продает свои секвенаторы. Их можно сделать совсем миниатюрными — величиной с флэшку. Они могут читать бегло: даже фрагменты ДНК длиной в миллионы нуклеотидов. Но нанопоровые секвенаторы все-таки довольно часто ошибаются. И когда биологам нужна абсолютная точность, они придерживаются «золотого стандарта» — секвенирования по Сенгеру.

Как писать на языке ДНК

Чтобы писать на языке ДНК, нужно для начала научиться составлять слова из букв алфавита. Собирать из нуклеотидов фрагменты ДНК генетики научились еще в 1970-е. Но этого все-таки мало. Мы учимся писать действительно содержательные сочинения, читая большие тексты. А большие тексты — это целые геномы живых организмов. Вот если бы мы научились составлять из них новые, такие, какие захотим…    

В 1980-е годы в ДНК бактерий была обнаружена странная структура. Были найдены повторяющиеся отрезки нуклеотидов. Они разделяли совершенно разные фрагменты примерно той же длины, что и они сами. 

Если заменить нуклеотиды цветными полосками, это можно представить так: Белый-Черный-Белый, а дальше Красный-Синий-Синий. Снова Белый-Черный-Белый, а дальше Синий-Белый-Красный. И так далее. Здесь Белый-Черный-Белый — это и есть повторяющийся разделитель. Но вот что он разделяет? 

Смысл этой структуры долго оставался неясен, но она встречалась у разных видов бактерий. Это указывало, что такая структура неслучайна. 

Уже в 2000-е годы было установлено, что эта структура — приобретенный иммунитет бактерий, в точном смысле слова — антивирусная система. Повторяющиеся отрезки — это действительно разделители, а различные фрагменты между ними — это фрагменты вирусных ДНК. Эта структура получила название CRISPR-кассета. 

Когда вирус проникает в бактерию, она сравнивает его ДНК с фрагментами, сохраненными в CRISPR-кассете. Если проникшая в клетку ДНК найдена в CRISPR-кассете, значит, это вирус, который и раньше проникал в бактерию. Тогда следует команда «уничтожить». Специальный белок CAS9 связывается с вирусом и режет его на кусочки. 

Если вирусная ДНК не найдена в CRISPR-кассете, то бактерия либо погибнет, либо сумеет вирус нейтрализовать. Тогда выжившие бактерии сохранят новую вирусную последовательность у себя в ДНК и передадут ее потомству. Так и формируется CRISPR-кассета.

Больше всего впечатлило генетиков, что бактерии умеют находить нужный отрезок кода и делать разрез именно в том месте, где этот отрезок найден. 

Если иммунная система бактерий умеет резать, то ДНК умеет еще и склеивать разрезы. За это отвечает система репарации, или восстановления, ДНК. При делении клетки в ДНК нередко возникают сбои. Механизм репарации ДНК может вырезать сбойный фрагмент и заменить его корректными. Для этого используется копия ДНК, сохраняемая в хромосоме. 

Если мы можем отыскивать нужный образец, его вырезать и вставить какой захотим, это уже полноценная система редактирования. Франк-Каменецкий подробно рассказывает, как работает технология генетического редактирования CRISPR/CAS9.

Формируется специальный вектор, который обязательно содержит три элемента. 

Во-первых, отрезок гидовой РНК: по нему как по образцу можно отыскать то место, где необходимо сделать разрез в ДНК.

Во-вторых, белок CAS9, который сделает в найденном месте разрез. 

И наконец, фрагмент ДНК, который будет вставлен на место разреза. 

Такой вектор вводится в клеточное ядро. 

Получается в точности редактирование: отыскали нужные места, сделали два разреза, выбросили лишний фрагмент, вклеили новый.

Теперь мы можем любую ДНК изменить, будь это хоть соя, хоть комар. О комарах Франк-Каменецкий говорит подробнее.

Мутагенная цепная реакция 

С помощью технологии редактирования генома мы можем в ДНК сохранить саму программу редактирования. Такая программа, например вектор, который мы описали, — это ведь тоже набор нуклеотидов. Тогда при активировании гена программа будет запущена.

Одной из первых была выполнена работа по включению такой программы в ДНК мушки дрозофилы. В ген, отвечающий за расцветку мушки, был встроен CRISPR-механизм по редактированию самого этого гена.

При активировании гена CRISPR-механизм запускался. Он находил гомологичную хромосому, отыскивал в ней ген, отвечающий за расцветку, и себя в него прописывал. В результате получалась гомозиготная клетка, которая обязательно передает при наследовании ген, содержащий CRISPR-механизм. Так и вышло. Почти все дрозофилы при наследовании получали отредактированный ген и рождались бледно-желтого цвета, как и было заказано. 

Если такой механизм передается по наследству, значит, мы можем с его помощью модифицировать целую популяцию организмов. Механизм был назван мутагенной цепной реакцией. Если механизм работает, то запрограммированная мутация охватывает всю популяцию со скоростью геометрической прогрессии. 

Есть предложение с помощью такой цепной реакции уничтожить комаров — переносчиков вируса Зика в Калифорнии и переносчиков малярийного плазмодия в Африке. Был предложен CRISPR-механизм, который работает так, что самцы становятся переносчиками гена бесплодия. Мутация делает бесплодными только самок. А самцы готовы к спариванию и продолжают ген бесплодия распространять. Достаточно сравнительно небольшой колонии отредактированных самцов, чтобы популяция вымерла. 

Эта работа была опубликована в конце 2015 года группой исследователей во главе с Тони Ноланом из Имперского колледжа в Лондоне. Почему же это не сделано, если в Африке каждый день от малярии умирают сотни людей? 

Франк-Каменецкий пишет: «Есть опасность, что CRISPR-механизм, несущий ген бесплодия, передастся от комаров, распространяющих малярию, к обычным, безвредным комарам, которые являются неотъемлемой частью экосистемы. Ими и их личинками питаются рыбы и лягушки; наверное, они играют еще какую-то роль. Хотим ли мы их уничтожения?» 

Что тут сказать? Нет, не хотим, потому что последствия такого уничтожения мы предсказать не можем.  

Будущее уже наступило

Завершая книгу, Франк-Каменецкий пишет: «Возникает острое ощущение, что, хорошо это или плохо, мы находимся на пороге эры массированного вмешательства в геном конкретных живых людей. И приход этой эры уже не остановить никакими начальственными окриками. Когда наконец откроют ген гениальности, сколько мамаш захотят чуть подправить геномы своих чад, чтобы из них выросли Яши Хейфецы и Альберты Эйнштейны».

Книга опубликована в 2017 году. А в конце 2018 года китайский генетик Хэ Цзянькуй сообщил, что родились близнецы — девочки Лулу и Нана, чей геном он сам отредактировал. Это вызвало большой шум, эксперименты по редактированию эмбриональных стволовых клеток человека запрещены практически по всем мире. Но будущее уже наступило. 

Заинтересовались книгой и хотите прочесть целиком? Скачайте бесплатно на Всенауке.